در دنیای میکروبیولوژی، شناسایی و بررسی خصوصیات متابولیکی باکتری‌ها یکی از کلیدهای اصلی در درک رفتار و توانایی‌های آن‌هاست. یکی از آزمایش‌های متداول در این زمینه، تست سیترات (آزمایش مصرف سیترات توسط باکتری‌ها) است که به عنوان یک شاخص مهم در شناسایی گونه‌های باکتریایی و ارزیابی توانایی آن‌ها در استفاده از منابع کربنی خاص شناخته می‌شود. این آزمایش به طور گسترده در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، صنایع غذایی و حوزه‌های بهداشتی کاربرد دارد و اطلاعات ارزشمندی درباره نوع و میزان فعالیت متابولیکی باکتری‌ها فراهم می‌کند.
در این مقاله از تهران لب، به بررسی اهمیت و کاربردهای این آزمایش خواهیم پرداخت و نقش آن را در مطالعات علمی و پزشکی توضیح می‌دهیم.
هدف از تست سیترات (Citrate)
تست سیترات که نشانگر مصرف سیترات توسط باکتری‌هاست، یکی از روش‌های رایج برای تفکیک و شناسایی گونه‌های مختلف باکتری، به‌ویژه باسیل‌های متعلق به خانواده انتروباکتریاسه، است. این آزمایش برای تعیین توانایی باکتری‌ها در استفاده از سیترات سدیم به عنوان تنها منبع کربن و آمونیوم به عنوان تنها منبع نیتروژن انجام می‌شود. توانایی مصرف سیترات به وجود آنزیمی به نام سیترات لیاز بستگی دارد که سیترات را به ترکیبات قابل استفاده برای تولید انرژی و رشد تجزیه می‌کند.
یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌ها برای بررسی توانایی مصرف سیترات، آزمایش سیمون سیترات (Simmons citrate) است. در این آزمایش، باکتری روی محیط کشت حاوی سیترات به عنوان تنها منبع کربن رشد می‌کند. اگر باکتری بتواند از سیترات استفاده کند، رشد کرده و محصولات قلیایی تولید می‌کند. این فرآیند باعث تغییر رنگ نشانگر pH (بروم تیمول بلو) از سبز به آبی می‌شود. آزمایش سیمون سیترات اغلب در میکروبیولوژی بالینی برای شناسایی باکتری‌های بیماری‌زا، به‌ویژه اعضای خانواده انتروباکتریاسه که توانایی مصرف سیترات را دارند، به کار می‌رود.
باکتری‌های متعددی توانایی مصرف سیترات را دارند. برخی از باکتری‌های سیترات مثبت شامل موارد زیر هستند:
- کلبسیلا
- انتروباکتر
- سیتروباکتر
- پروویدنسیا
- پروتئوس
- سراتیا
- ویبریو کلرا
- سودوموناس
- سالمونلا انتریتیدیس
- اعضای زیرجنس سالمونلا II، III و IV
این باکتری‌ها به دلیل وجود آنزیم سیترات لیاز و سایر مسیرهای متابولیک قادر به استفاده از سیترات به عنوان منبع کربن هستند. در مقابل، باکتری‌های سیترات منفی مانند اشریشیا کلی، حتی در شرایط هوازی، توانایی مصرف سیترات به عنوان منبع کربن را ندارند. این آزمایش به تفکیک باکتری‌های سیترات مثبت از سیترات منفی کمک می‌کند و نقش مهمی در شناسایی و طبقه‌بندی باکتری‌ها دارد.
آزمایش مصرف سیترات یکی از آزمایش‌های بیوشیمیایی است که به طور معمول به عنوان بخشی از مجموعه تست‌های IMViC (ایندول، متیل رد، VP و سیترات) برای تمایز بین اعضای خانواده انتروباکتریاسه بر اساس فرآورده‌های متابولیکی استفاده می‌شود.
این آزمایش می‌تواند برای تفکیک کلی‌فرم‌ها مانند کلبسیلا آئروژنز (که قبلا به نام انتروباکتر آئروژنز شناخته می‌شد و در محیط‌های خاکی و آبی یافت می‌شود) از کلی‌فرم‌های مدفوعی مانند اشریشیا کلی (که حضور آن نشان‌دهنده آلودگی مدفوعی است) به کار رود.
اساس آزمایش مصرف سیترات
آزمایش مصرف سیترات توانایی باکتری در استفاده از سیترات سدیم به عنوان تنها منبع کربن و دی‌هیدروژن فسفات آمونیوم (NH4H2PO4) به عنوان تنها منبع نیتروژن را بررسی می‌کند.
هنگامی که سیترات، به‌عنوان یک اسید آلی (در چرخه کربس)، به منبع کربن و انرژی تبدیل می‌شود، کربنات‌های قلیایی و بی‌کربنات‌ها تولید می‌شوند که باعث افزایش pH محیط و تغییر رنگ آن می‌شوند.
آنزیم سیترات لیاز برای مصرف سیترات ضروری است. این آنزیم، سیترات را به اکسالو‌استات و استات تجزیه می‌کند. سپس اکسالو‌استات به پیروات و دی‌اکسید کربن (CO2) تجزیه می‌شود:
- سیترات → اکسالو‌استات + استات
- اکسالو‌استات → پیروات + CO2
تغییرات متابولیکی در محیط
- در شرایط قلیایی، پیروات به استات و فرمات تبدیل می‌شود:
- پیروات → استات + فرمات
- در pH 7.0 و پایین‌تر، محصولات دیگری مانند لاکتات و استوئین نیز تولید می‌شوند:
- پیروات → استات + لاکتات + CO2
- پیروات → استوئین + CO2
دی‌اکسید کربن تولیدشده با آب و یون سدیم واکنش داده و کربنات سدیم (یک ترکیب قلیایی) تولید می‌کند که باعث افزایش pH محیط می‌شود. همچنین، مصرف نمک‌های آمونیوم در محیط منجر به تولید هیدروکسید آمونیوم می‌شود که افزایش pH را تقویت می‌کند.
نقش نشانگر بروموتیمول بلو
بروموتیمول بلو، نشانگر pH مورد استفاده در این آزمایش، در pH خنثی به رنگ سبز تیره است. با افزایش pH به بالای 7.6، این نشانگر به رنگ آبی تغییر می‌کند که نشان‌دهنده مصرف سیترات و رشد باکتری است.
کاربردهای تست سیترات
- شناسایی و تمایز بین گونه‌های خانواده انتروباکتریاسه
- تشخیص باکتری‌های بیماری‌زا در محیط‌های بالینی و زیست‌محیطی
- تمایز بین کلی‌فرم‌های مدفوعی و غیرمدفوعی
محدودیت‌های تست سیترات
- نتایج مثبت یا منفی باید همراه با سایر تست‌های بیوشیمیایی تفسیر شوند.
- برخی از گونه‌های باکتری ممکن است نیاز به زمان طولانی‌تری برای رشد و تولید نتایج داشته باشند.
با این روش، آزمایش مصرف سیترات به عنوان یک ابزار مؤثر برای شناسایی ویژگی‌های متابولیکی باکتری‌ها و کمک به تحقیقات علمی و تشخیص بالینی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
مراحل آماده‌سازی محیط سیمون سیترات (Simmons Citrate)
- حل کردن نمک‌ها: تمامی نمک‌های ذکرشده را در آب دیونیزه حل کنید.
- تنظیم pH :pH محلول را روی 6.9 تنظیم کنید.
- افزودن آگار و بروموتیمول بلو: به محلول، آگار و نشانگر بروموتیمول بلو اضافه کنید.
- حرارت دادن: محلول را به آرامی حرارت دهید و با هم زدن، آن را بجوشانید تا آگار کاملا حل شود.
- تقسیم در لوله‌ها: 0 تا 5.0 میلی‌لیتر از محلول را در لوله‌های آزمایش 16 میلی‌متری بریزید.
- اتوکلاو: لوله‌ها را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار 15 psi به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید.
- خنک کردن: پس از اتوکلاو، لوله‌ها را به صورت مایل قرار دهید تا محیط به شکل شیب‌دار (انتهای کم‌عمق و بلند) خنک شود.
- نگهداری: لوله‌های آماده‌شده را در یخچال نگهداری کنید. این محیط معمولا بین 6 تا 8 هفته ماندگاری دارد.
- رنگ اولیه محیط: محیط تلقیح‌نشده به دلیل pH و وجود بروموتیمول بلو، به رنگ سبز جنگلی تیره خواهد بود.
روش انجام آزمایش مصرف سیترات (Citrate)
برای انجام این آزمایش، با استفاده از نوک سوزن استریل، یک تلقیح سبک از کلنی 18 تا 24 ساعته روی سطح شیب‌دار آگار سیمون سیترات انجام دهید. نیازی به تلقیح در انتهای لوله نیست و از کشت مایع نیز نباید استفاده شود تا از تلقیح بیش‌ازحد سنگین جلوگیری شود. لوله‌ها را در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید. انکوباسیون ممکن است تا 7 روز ادامه یابد. در پایان، محیط را برای مشاهده تغییر رنگ به آبی بررسی کنید که نشان‌دهنده قلیایی شدن و مصرف سیترات است.
تفسیر نتایج تست سیترات
تفسیر نتایج تست سیترات به توانایی باکتری در مصرف سیترات به‌عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن بستگی دارد. این توانایی با رشد باکتری و تغییر رنگ محیط به آبی یا سبز مشخص می‌شود. جزئیات کامل درباره نتایج مثبت و منفی این آزمایش در ادامه شرح داده شده است.
نتیجه مثبت تست سیترات
در آزمایش استفاده از سیترات، اگر باکتری توانایی مصرف سیترات به عنوان تنها منبع کربن را داشته باشد، رشد آن بر روی محیط مشاهده می‌شود. این رشد ممکن است با تغییر رنگ نشانگر بروموتیمول بلو از سبز به آبی همراه باشد یا بدون تغییر رنگ قابل توجه در نشانگر باشد. تغییر رنگ نشان‌دهنده تولید محصولات متابولیکی قلیایی یا اسیدی توسط باکتری در هنگام استفاده از سیترات است. نمونه‌هایی از باکتری‌های مثبت در این آزمایش شامل سالمونلا، ادواردسیلا، سیتروباکتر، کلبسیلا، انتروباکتر، سراتیا و پروویدنسیا هستند.
نتیجه منفی تست سیترات
اگر باکتری توانایی مصرف سیترات را نداشته باشد، هیچ رشدی بر روی محیط مشاهده نمی‌شود و رنگ شیب محیط کشت سبز باقی می‌ماند. این نشان می‌دهد که باکتری نتوانسته است از سیترات سدیم به عنوان منبع کربن استفاده کند. باکتری‌هایی مانند اشریشیا کلی، شیگلا، مورگانلا و یرسینیا معمولا نتیجه منفی در این آزمایش نشان می‌دهند.
ترکیب محیط کشت برای انجام تست سیترات
در آزمایش مصرف سیترات، محیط کشت سیتراتی که بیشترین استفاده را دارد، فرمول سیمونز است. این محیط به صورت شیب‌دار در لوله ریخته می‌شود. ترکیب محیط آگار سیمونز به شرح زیر است:
| ماده | مقدار (گرم در لیتر) |
| آمونیوم دی‌هیدروژن فسفات | 1 |
| دی‌پتاسیم فسفات | 1 |
| سدیم کلرید | 5 |
| سدیم سیترات | 2 |
| منیزیم سولفات | 0.2 |
| آگار | 15 |
| برموتیمول بلو | 0.08 |
| آب مقطر | 1 |
| PH نهایی | 6.9 |
مراحل انجام تست سیترات
- تلقیح محیط: نوک سوزن استریل را به یک کلنی 18 تا 24 ساعته بزنید و تلقیح سبکی روی سطح شیب‌دار آگار سیمون سیترات انجام دهید.
- بستن درپوش: درپوش لوله را به صورت شل روی آن قرار دهید.
- انکوباسیون: لوله را در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد به صورت هوازی انکوبه کنید. مدت انکوباسیون معمولا 18 تا 24 ساعت است، اما برخی از ارگانیسم‌ها به دلیل نرخ رشد محدودشان روی محیط سیترات ممکن است تا 7 روز زمان نیاز داشته باشند.
- مشاهده نتایج: تغییر رنگ به آبی در سطح شیب‌دار را بررسی کنید که نشان‌دهنده قلیایی شدن محیط است.
باکتری‌های سیترات مثبت
بسیاری از اعضای خانواده انتروباکتریاسه سیترات مثبت هستند، از جمله:
- کلبسیلا پنومونیه
- گونه‌های انتروباکتر (اقلیت سویه‌ها ممکن است نتیجه منفی نشان دهند)
- سیتروباکتر فروندی
- سالمونلا (به‌جز گونه‌های Typhi و Paratyphi A)
- سراتیا مارسسنس
- پروتئوس میرابیلیس (برخی سویه‌ها ممکن است منفی باشند)
- پروویدنسیا
باکتری‌های سیترات منفی
معروف‌ترین باکتری‌های سیترات منفی هم عبارتند از:
- اشریشیا کلی
- گونه‌های شیگلا
- سالمونلا تایفی
- سالمونلا پاراتایفی A
- مورگانلا مورگانی
- یرسینیا انتروکولیتیکا
آزمایش سیترات در منزل و شرایط انجام این آزمایش در منزل
آزمایش سیترات یک آزمایش تخصصی میکروبیولوژی است که برای شناسایی توانایی باکتری‌ها در مصرف سیترات به‌عنوان منبع کربن طراحی شده و نیازمند شرایط خاصی است، از جمله محیط کشت اختصاصی، تجهیزات دقیق، و شرایط استریل. به دلیل این الزامات، انجام این آزمایش به‌طور کامل در منزل امکان‌پذیر نیست. حتی نمونه‌گیری اولیه برای این تست نیازمند جداسازی و خالص‌سازی نمونه باکتریایی در محیط‌های کاملا کنترل‌شده آزمایشگاهی است.
بنابراین، اگرچه بسیاری از آزمایش‌ها مانند آزمایش خون یا مدفوع می‌توانند در منزل نمونه‌گیری شوند، آزمایش سیترات به دلیل ماهیت فنی و حساسیت فرآیند، باید به طور کامل در آزمایشگاه انجام شود. مراکز تخصصی مانند تهران لب امکان ارائه خدمات نمونه‌گیری و انجام آزمایش‌های مناسب‌تر در منزل را دارند، اما برای آزمایش‌های میکروبیولوژی خاص مانند سیترات، نمونه باید در محیط آزمایشگاهی کشت و بررسی شود.
برای درخواست هرگونه مشاوره تلفنی و نمونه‌گیری در آزمایشگاه جهت انجام آزمایش مصرف سیترات، با تلفن 1650 آزمایشگاه پاتوبیولوژی و ژنتیک پزشکی تهران لب تماس بگیرید.
آنچه از مقاله «کاربرد آزمایش مصرف سیترات توسط باکتری‌ها چیست؟» آموختیم
آزمایش مصرف سیترات (تست سیترات) یکی از روش‌های مهم در شناسایی و تمایز باکتری‌ها، به‌ویژه اعضای خانواده انتروباکتریاسه است. این آزمایش به ما کمک می‌کند تا توانایی باکتری‌ها در استفاده از سیترات به عنوان منبع کربن و نیتروژن را ارزیابی کنیم و از این طریق به شناسایی دقیق‌تری از گونه‌های مختلف باکتری‌ها دست یابیم. نتایج این آزمایش می‌تواند در تشخیص بیماری‌ها و همچنین شناسایی آلودگی‌های محیطی نقش به‌سزایی داشته باشد.
ما در آزمایشگاه تهران لب در تلاش هستیم تا انجام آزمایش‌های مختلف را برای شما عزیزان با بالاترین دقت، سریع‌ترین زمان و راحت‌ترین پروسه انجام آزمایش ارائه دهیم. در این راستا می‌توانید برای انجام بسیار از آزمایش‌ها مانند انواع آزمایش خون، آزمایش مدفوع و ادرار و…، درخواست انجام آزمایش در خانه را در سایت ثبت کنید تا کارشناسان ما برای انجام آزمایش در محل شما حاضر شوند.
منبع:
https://microbiologyinfo.com/citrate-utilization-test-principle-media-procedure-and-result/
